Internship reports and monograph titled "CRISPR / cas9 for modelling of brain diseases".

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de FarmáciaCompreender e tratar o cérebro permanece um dos maiores desafios da ciência, pelo que novas ferramentas que possam contribuir para vencer estes desafios constituem uma importante esperança. O advento do sistema CRISPR (Clustered Regulated Interspaced Palindromic Repeats) teve um enorme impacto nas ciências da vida e em particular nas neurociências, visto que inúmeras patologias neurológicas resultam de defeitos genéticos. Esta ferramenta de edição genética permite quer a correção, quer a reprodução destes defeitos em modelos de doença do cérebro de forma mais expedita e precisa que as técnicas anteriormente disponíveis. Nesta monografia focamo-nos na utilização desta tecnologia para a produção de modelos de doença. O sistema CRISPR/Cas 9 é composto por uma endonuclease (Cas9) guiada por meio de um RNA de cadeia dupla, CRISPR RNA (crRNA) e um CRISPR RNA transactivador (tracrRNA), ou alternativamente um único RNA guia (sgRNA) que complexam com a enzima. Este complexo é direcionado ao fragmento de DNA-alvo e, após o emparelhamento, a Cas9 origina a clivagem da cadeia dupla de DNA, no local-alvo. É de notar, que é requisito para a atividade de nuclease da Cas 9 a existência do domínio PAM, um conjunto de três nucleótidos altamente conservados, imediatamente a jusante do local de corte. As quebras duplas na cadeia de DNA (DSBs) podem ser reparadas por dois mecanismos: a união das extremidades não-homóloga (NHEJ) ou por Recombinação Homóloga (HDR). Através destes mecanismos de reparação podemos induzir disrupção de genes (knock-out) ou inserção específica de segmentos (knock-in). Assim, empregando o sistema CRIPSR/Cas 9 é possível a geração, numa única etapa, de modelos celulares e animais, com as mutações que pretendemos estudar. Resumidamente, o processo de investigação envolve três passos:1. Estudos genéticos identificam a mutação genética, relacionada com a doença neurológica;2. A CRISPR é usada quer para disrupção ou inserção de mutações específicas, nos genes identificados;3. Modelos (animais, celulares) da doença são estudados com vista a clarificar processos patológicos, bem como usados na identificação de novos fármacos, que permitam reverter ou bloquear a progressão da doença. No entanto, esta ferramenta, tem também limitações que importa conhecer para uma correta utilização e aperfeiçoamento deste sistema na produção de modelos de doenças do cérebro. Entre estas limitações contam-se os efeitos fora do alvo; meios de vectorização deficientes; ineficiência dos mecanismos de reparação de DNA por homologia no cérebro, mosaicismo. Em resumo, os sistemas de edição genética baseados na CRISPR-Cas9 são uma enorme esperança na produção de novos modelos de doença, mais perfeitos e relevantes, mas ainda com complexidades e limitações que importa ultrapassar de forma a tirar o máximo partido destes e a alcançar os esperados avanços no conhecimento e tratamento das doenças do cérebro.Understanding and treating the brain remain one of the biggest challenges to science, so tools that can aid to overcome these challenges are highly promising. The advent of the CRISPR system has had a tremendous impact on life sciences and particularly in neuroscience, since numerous neurological disorders stem from genetic defects. Thus, this genetic editing tool is important for both the removal, as well as the reproduction of these defects, for the generation of brain disease models.CRISPR / Cas 9 is a system consisting of an endonuclease (Cas9) guided by a double-RNA, CRISPR RNA (CRRNA) and trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA), or alternatively, a single guide RNA (sgRNA) which complexes with the enzyme. This complex targets a DNA sequence and, after annealing, Cas9 causes double-stranded breaks, at the target site. It should be noted that the existence of a PAM domain is required for the activity of Cas9, immediately following the target sequence. Double stranded breaks (DSBs) can be repaired by two mechanisms: non-homologous end-joining (NHEJ) or Homologous Recombination (HR). Through these repair mechanisms we can induce gene disruption (knock-out) or sequence-specific insertion (knock-in). Thus, using the CRIPSR / Cas 9 system, it is possible to generate, in a single step, cellular and animal models, with the mutations we intend to study.Briefly, the research process involves three-steps:1. Genetic studies identify the genetic mutation, related to the neurological disease;2. CRISPR is used either for disruption or insertion of specific mutations in the genes identified;3. Animal models of the disease are studied in order to clarify pathological processes as well as used in the testing of new drugs as a way of evaluating disease regression.However, not only advantages accompany this tool, it is also necessary to discuss its limitations (off-target, means of effective vectorization, DNA repair mechanisms inefficient, mosaicism), to correctly discuss the future of this system in the production of models of brain diseases.In summary, gene-editing systems based in CRISPR-Cas9 are a huge hope in the production of new models of disease, perfected and more relevant, but still with complexities and limitations that are important to overcome in order to take maximum profit and reach the expected advances in the knowledge and treatment of brain disorders